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BACTEC FX 全自动系统用于药品快速无菌快速检查的评价研究
上海市食品药品检验所，国家药品监督管理局药品微生物检测技术重点实验室，上海 201203
摘要：目的：评价 BACTEC FX 全自动系统用于无菌快速检查的可行性。方法：选择 15 种不同类型的无菌制剂，参照 2015 年版中国药典四部药品微生物检验替代方法验证指导原则，以中国药典无菌检查法为参考，考察该方法的专属性、检测限、重复性的及耐用性。结果：专属性试验结果表明该系统适用于部分无菌制剂的无菌检查，其中，对于丙泊在注射液，该系统的无菌检查结果与药典方法基本相当。结论：BACTEC FX 全自动系统用于药品无菌检查具有快速、灵敏度高的优势，有望为常规无菌检查法带来有效的补充。
关键词：无菌检查；CO2 检测技术；快速检测技术；BACTEC FX
Keywords: sterility test; CO2 detection technology; rapid microbiological method (RMM); BACTEC FX
无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器械、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法[1]。无菌检查法是最古老和成熟的微生物检测方法之一。最早可追溯至 1932 年的英国药典[2]，我国的第一部药典（1953 年版）也收载了无菌检查法。在此之后的药典改版中，国内外药典对于无菌检查法进行了多次修订，目前各国药典[3-5]基本协调统一，均采用培养基浑浊观察法判断产品的无菌状况，培养周期一般不少于 14 天。该方法的适用性较强，但也有一些限制，较长的培养周期难以应对重大药害事件对时间的紧迫需求；依靠培养基浑浊观察法受操作人员经验影响较大，具有一定的主观性，而且在整个检查过程中需要反复观察，操作繁琐，自动化程度低，缺乏一定的可追溯性[6]。近年来，各国药典和法规均鼓励新技术应用于微生物领域，如聚合酶链式反应（PCR）技术[7]、三磷酸腺苷(ATP)发光检测技术[8]、pH/CO2 电阻检测[9-11]等，这些快速微生物检测技术有效的提升了药品微生物的检出效率。
BACTEC FX 全自动系统是基于微生物生长原理，培养瓶内的各种营养物质可提供微生物生长的物质基础，而微生物生长过程中的代谢产物之一 CO2 将激活瓶内底部荧光感应物质而发出荧光，荧光信号变化与 CO2 变化成正比。仪器瓶位内的探测器探测到该荧光信号的变化并经一系列运算公式的运算，得出荧光信号变化的各种参数，从而判断培养瓶内是否有微生物生长。该系统目前在临床领域应用较为广泛[12]，也有用于无菌样品的检测的报道[13-14]。
本研究选择了 15 种典型的无菌制剂，参照 2015 年及 2020 年版中国药典四部通则<9201>药品微生物检验替代方法验证指导原则的有关内容，对 BACTEC FX 全自动系统与中国药典的无菌检查法进行了系统比较。同时选取特定品种，全面评估 BACTEC FX 全自动系统与中国药典的无菌检查法在专属性、检测限、重复性以及耐用性是否存在差异。为该品种是否能采用 BACTEC FX 全自动系统进行无菌快速检测提供依据。
1 仪器与材料
1.1 试验仪器
BACTECTM FX40 全自动系统（美国，BD 公司）。
1.2 试验菌株
金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003 、大肠埃希菌 CMCC(B)44102 、铜绿假单胞菌
CMCC(B)10104、生孢梭菌 CMCC(B)64941、枯草芽孢杆菌 CMCC(B)63501、白色念珠菌
CMCC(F)98001、黑曲霉 CMCC(F)98003 均购于中国医学细菌菌种保藏管理中心(CMCC)。
1.3 试验样品
序号 | 样品名称 | 规格 |
1 | 碘海醇注射液 | 100ml |
2 | 盐酸氨溴索注射液 | 2 ml |
3 | 门冬氨酸钾镁注射液 | 10 ml |
4 | 丙泊注射液 | 20 ml |
5 | 依托咪酯乳状注射液 | 10 ml |
6 | ω-3 鱼油脂肪乳注射液 | 100 ml |
7 | 结构脂肪乳注射液 | 250 ml |
8 | 注射用丁二磺酸腺苷蛋氨酸 | 5ml:5g |
9 | 注射用还原型谷胱甘肽 | 0.6g |
10 | 吡诺克辛滴眼液 | 5 ml |
11 | 复方托吡卡胺滴眼液 | 10 ml |
12 | 氟米龙滴眼液 | 5 ml |
13 | 羧甲基纤维素钠滴眼液 | 0.4 ml |
14 | 吸入用丙酸倍氯米松混悬液 | 2 ml |
15 | 注射用硫酸多黏菌素 B | 50 万单位 |
1.4 试验用试剂及培养基
硫乙醇酸盐液体培养基、胰酪大豆胨液体培养基及胰酪大豆胨琼脂培养基均购自北京三药科技开发公司。
BACTECTM Standard/10 Aerobic/F 标准需氧瓶、BACTECTM Lytic/10 Anaerobic/F 含溶血素厌氧瓶及 BACTEC ™ PLUS+ Aerobic/F 树脂需氧瓶均购于美国 BD 公司。
2 方法
2.1 无菌检查
药典组：按照 2015 年版中国药典四部通则<1101>的规定，采用薄膜过滤法，接种硫乙醇酸盐液体培养基置于 32.5℃，胰酪大豆胨液体培养基置于 22.5℃培养 5d，每天观察结果。
BACTEC FX 组（FX 组）：将一定量供试品和<100cfu 试验菌加入标准需氧瓶或厌氧瓶中混匀，直接上机检测，温度设置 35℃，培养时间为 5d，机器自动运行发现阳性后判读并报警。
比较药典组和 FX 组的 5d 的生长情况。
2.2 丙泊注射液无菌快速检查的评价
2.2.1 专属性
专属性试验方法同 2.1，药典组和 FX 组每种试验菌平行进行三次独立试验。
2.2.2 检测限
药典组和 FX 组的样品接种方法与专属性相同，供试品中加入＜2cfu 的试验菌，每种试验菌重复进行 10 次。
2.2.3 重复性
由不同的实验人员于不同的实验时间，在不同的实验室，按照专属性方法取样和接种， 进行重复性试验，考察方法的精密度。
2.2.4 耐用性
增加样品的接种量至 10ml、20ml 或延迟 24 上机，其他参考专属性试验不变，考察 FX
组方法的耐用性。
3 结果
3.1 无菌检查
15 个试验样品的无菌检查结果表明，药典组和 FX 组的促生长能力基本相同，FX 组对 7 株试验菌的促生长能力普遍快于药典组（表 1 和表 2）；但是仍有 4 个品种：盐酸氨溴索注射液、吡诺克辛滴眼液、复方托吡卡胺滴眼液和氟米龙滴眼液出现“假阴性"的结果。将接种量由 4ml 减少至 1ml，盐酸氨溴索注射液能在规定时间内报告阳性，而其余 3 种滴眼液仍未能消除“假阴性"（表 3）。进一步采用带中和效果的树脂瓶进行实验，恢复 4ml 的接种量，四种样品均在规定时间给出阳性结果（表 3）。
表 1 FX 组检出时间(d/h/min)
Tab.1 Detection time of FX group(d/h/min)
序号(No .) | 样品名称 (sample) | 大肠埃希氏菌(Escheric hia coli) | 金黄色葡萄球菌(Staphylococ cus aureus) | 生孢梭菌(Clostridi um sporogene s) | 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) | 白色念珠菌(Candid a albicans ) | 黑曲霉(Aspergill us niger) | 铜绿假单胞菌(Pseudomo nas aeruginosa) |
1 | 碘海醇注射液 (Iohexol injection) | 0:08:28 | 0:13:06 | 0:11:37 | 0:09:15 | 0:14:18 | 1:23:45 | 0:15:08 |
2 | 盐酸氨溴索注射液(Ambroxol Hydrochloride Injection) | - | 0:20:12 | 0:06:57 | 5:06:38 | 0:15:17 | - | 0:16:44 |
3 | 门冬氨酸钾镁注射液 （Potassium magnesium aspartate injection） | 0:08:27 | 0:14:13 | 0:12:07 | 0:09:54 | 0:14:46 | 2:02:04 | 0:15:34 |
4 | 丙泊注射液 （Propofol injection） | 0:08:36 | 0:13:48 | 0:10:35 | 0:09:43 | 0:13:54 | 2:13:33 | 0:15:04 |
5 | 依托咪酯乳状注射液（Etomidate emulsion injection） | 0:08:16 | 0:12:27 | 0:12:55 | 0:09:02 | 0:13:54 | 3:12:53 | 0:15:34 |
6 | ω-3 鱼油脂肪乳注射 液（ω-3 Fish Oil Fat Emulsion Injection） | 0:08:25 | 0:12:27 | 0:10:35 | 0:09:42 | 0:14:03 | 3:12:53 | 0:15:37 |
7 | 结构脂肪乳注射液 （Structural Fat Emulsion Injection） | 0:08:25 | 0:12:17 | 0:10:34 | 0:09:32 | 0:13:43 | 1:23:24 | 0:15:37 |
8 | 注射用丁二磺酸腺苷蛋氨酸 （Ademetionine 1,4 - Butanedisulfonate for Injection） | 1:01:13 | 0:21:06 | 4:07:04 | 0:14:11 | 0:15:42 | 2:02:12 | 0:18:47 |
9 | 注射用还原型谷胱甘肽 （Reduced Glutathione For Injection ） | 0:08:15 | 0:16:55 | 0:10:44 | 0:11:01 | 0:16:13 | 2:12:52 | 0:17:04 |
10 | 吡诺克辛滴眼液 （Pirenoxine Ophthalmic Solution） | 0:08:17 | - | 0:12:17 | - | 0:14:25 | - | 0:15:54 |
11 | 复方托吡卡胺滴眼液 （Compound Tropicamide Eye Drops） | 0:20:37 | - | - | - | 1:04:41 | - | 0:17:04 |
12 | 氟米龙滴眼液 （Fluorometholone Eye Drops） | 0:08:26 | - | 0:11:06 | - | 0:14:14 | - | 0:15:45 |
13 | 羧甲基纤维素钠滴眼液 （Carboxymethylcell ulose Sodium Eye Drops） | 0:08:26 | 0:12:38 | 0:13:15 | 0:09:53 | 0:14:14 | 1:18:43 | 0:16:05 |
14 | 吸入用丙酸倍氯米松混悬液 （Beclomethasone dipropionate inhalation suspension） | 0:08:15 | 0:13:36 | 0:11:04 | 0:09:22 | 0:13:43 | 2:12:42 | 0:15:36 |
15 | 阴性对照 (Negative Control) | - | - | - | - | - | - | - |
16 | 阳性对照 (Positive Control) | 0:08:03 | 0:12:33 | 0:10:23 | 0:09:11 | 0:14:10 | 1:14:38 | 0:15:04 |
注：“-"表示培养 5 天仍未报阳性结果。
Note:"-"means that no positive results have been reported after 5 days.
表 2 药典组检出时间(d)
Tab.2 Detection time of pharmacopoeia group(d)
序号 (No.) | 样品名称 (sample) | 大肠埃希氏菌 (Escherichia coli) | 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) | 生孢梭菌(Clostridium sporogenes) | 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) | 白色念珠菌 (Candida albicans) | 黑曲霉(Aspergillus niger) | 铜绿假单胞 菌 (Pseudomonas aeruginosa) |
1 | 碘海醇注射液 (Iohexol injection) | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 |
2 | 盐酸氨溴索注射液 (Ambroxol Hydrochloride Injection) | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 |
3 | 门冬氨酸钾镁注射液 （Potassium magnesium aspartate injection） | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 |
4 | 丙泊注射液 （Propofol injection） | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 |
5 | 依托咪酯乳状注射液 （Etomidate emulsion injection） | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 |
6 | ω-3 鱼油脂肪乳注射液 （ω-3 Fish Oil Fat Emulsion Injection） | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 |
7 | 结构脂肪乳注射液 （Structural Fat Emulsion Injection） | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 |
8 | 注射用丁二磺酸腺苷蛋氨酸 （Ademetionine 1,4 - Butanedisulfonate for Injection） | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 |
9 | 注射用还原型谷胱甘肽 （Reduced Glutathione For Injection ） | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 |
10 | 吡诺克辛滴眼液 （Pirenoxine Ophthalmic Solution） | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 |
11 | 复方托吡卡胺滴眼液 （Compound Tropicamide Eye Drops） | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 |
12 | 氟米龙滴眼液 （Fluorometholone Eye Drops） | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 |
13 | 羧甲基纤维素钠滴眼液 （Carboxymethylcellulose Sodium Eye Drops） | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 |
14 | 吸入用丙酸倍氯米松混悬液（Beclomethasone dipropionate inhalation suspension） | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 |
15 | 阴性对照 (Negative Control) | - | - | - | - | - | - | - |
16 | 阳性对照 (Positive Control) | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 |
注：“-"表示培养 5 天仍未报阳性结果。
Note:"-"means that no positive results have been reported after 5 days
表 3 FX 组减少接种量或采用树脂瓶检出时间(d/h/min)
Tab.3 Detection time of FX group after reducing inoculation volume or changing to BACTEC ™ PLUS+ Aerobic/F medium(d/h/min)
样品名称 (sample) | 培养瓶(culture medium) | 接种量 ( inoculation volume) （ml） | 大肠埃希氏菌 (Escherichia coli) | 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) | 生孢梭菌(Clostridium sporogenes) | 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) | 黑曲霉(Aspergillus niger) |
盐酸氨溴索注射液 (Ambroxol Hydrochloride Injection) | 标 准 瓶 (Standard) | 1 | 00:08:23 | / | / | / | 1:23:23 |
4 | 00:10:15 | / | / | / | 01:09:47 | ||
树 脂 瓶 (PLUS+) | |||||||
吡诺克辛滴眼液 （Pirenoxine Ophthalmic Solution） | 标 准 瓶 (Standard) | 1 | / | - | / | - | - |
树 脂 瓶 (PLUS+) | 4 | / | 01:01:44 | / | 01:15:15 | 01:10:17 | |
复 方 托 吡 卡 胺滴眼液（ Compound Tropicamide Eye Drops） | 标 准 瓶 (Standard) | 1 | / | - | 00:18:34 | - | - |
树 脂 瓶 (PLUS+) | 4 | / | 02:03:36 | / | 01:15:15 | 01:16:46 | |
氟米龙滴眼液 （Fluorometholone Eye Drops） | 标 准 瓶 (Standard) | 1 | / | - | / | - | - |
树 脂 瓶 (PLUS+) | 4 | / | 00:16:34 | / | 00:13:05 | 01:10:16 |
注：“-"表示培养 5 天仍未报阳性结果，“/"表示未进行试验。
Note:"-"means that no positive results have been reported after 5 days,"/" means no t tested.
3.3 丙泊注射液无菌快速检查的评价
3.3.1 专属性试验结果 按照 2015 年版中国药典无菌检查的规定，丙泊在注射液在药典组和 FX 组的添加的 7 株菌在 5 天内均能正常生长，2 种方法的专属性不存在差异。
3.3.2 检测限试验结果 采用 SPSSV13.0 fisher 确切概率法，对上述 7 株试验菌的检测限试验结果分别进行统计分析（表 4）， 2 种方法的检测限差异无显著性差异。
表 4 丙泊注射液检测限试验结果
Tab.3 Results of detection limit of propofol injection.
试验平 行 | 大肠埃希氏菌 (Escherichia coli) | 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) | 白色念珠菌(Candida albicans) | 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) | 黑曲霉(Aspergillus niger) | 生孢梭菌(Clostridium sporogenes) | 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) | |
(N | 药典组 FX | 药典组 FX | 药典组 FX | 药典组 FX 组/h | 药典组 FX | 药典组 FX | 药典组 FX | |
o.) | （Chp） 组 /h | （Chp） 组 /h | （Chp） 组 /h | （Chp） | （Chp） 组 /h | （Chp） 组 /h | （Chp） 组 /h | |
/d | /d | /d | /d | /d | /d | /d | ||
1 | 1 11.5 | 2 17.5 | 2 30 | 2 11.5 | 2 93.5 | 1 17 | 1 18.5 | |
2 | 1 11.5 | 2 17.5 | 2 30 | 2 11.5 | 3 93.5 | 2 18 | 1 19.5 | |
3 | 1 11.5 | 2 17.5 | 2 31.5 | 2 13 | 3 94 | - 18 | 1 19.5 | |
4 | 2 11.5 | 3 18.5 | 2 31.5 | 2 13 | 3 98.5 | - 18.5 | 2 20 | |
5 | 2 12 | - - | 2 31.5 | 2 13.5 | 3 - | - - | 2 - | |
6 | 2 12.5 | - - | 2 32.5 | 2 14 | 3 - | - - | - - | |
7 | 2 13.5 | - - | - 33 | 3 - | 4 - | - - | - - | |
8 | - 19 | - - | - 37 | - - | - - | - - | - - | |
9 | - 21 | - - | - - | - - | - - | - - | - - | |
10 | - - | - - | - - | - - | - - | - - | - - |
注：“-"表示培养 5 天仍未报阳性结果。
Note:"-"means that no positive results have been reported after 5 days
重复性试验结果 在 5d 内，2 种方法的 7 株试验菌均正常生长， FX 组的重复性与药典组相当。
耐用性试验结果 FX 组在接种量、上机时间发生变化的情况下，7 株试验菌均能在 5d 内被检出，检查结果不受影响，方法可正常使用。
4 讨论
本研究选择了无菌制剂的代表剂型，包括注射剂和滴眼剂等，涵盖了液体制剂和固体制剂，规格不等，选择的样品数量较多，同时，增加了铜绿假单胞菌作为试验菌株，未见同类报道。由于 BACTEC FX 全自动系统的检验原理与直接检查法基本相同，因此选择的样品大多为无抑菌性的样品。试验结果表明，BACTEC FX 系统并非适用于所有品种。以滴眼剂为例，3 种多剂量的滴眼液出现假阴性结果，而一次性使用的滴眼液未见异常，推测可能是多剂量的滴眼液中的防腐剂对结果造成了干扰。由于 BACTECFX 系统采用的是直接接种法，全组份均在培养基中，而药典方法为薄膜过滤法，推测原辅料被滤过，对结果影响较小。
为了消除样品中可能存在的抑菌成分的影响，我们选择了具有特殊吸附性的树脂需氧瓶，该培养瓶由“带正电荷树脂"和“多价吸附树脂"组成，可全面吸附多种抑菌成分，树脂孔径也为微生物的生长提供了附着表面，更有利于微生物生长。可以在不改变接种量的基础上，获得准确的结果。采用标准需氧瓶结果为阴性的 4 个样品在采用树脂瓶后，结果均为阳性。同时，我们也采用树脂瓶对注射用硫酸多黏菌素 B 进行了人工污染实验（结果未列出），除添加大肠埃希氏菌的培养瓶未能正常生长以外，其余 6 株菌均正常生长，提示树脂瓶无法*中和此类抗生素的抑菌性。脂肪乳类无菌产品一直是无菌检查中的一类难点，由于样品本身的浑浊特性，在采用常规药典方法进行无菌检查时，供试品管易显浑浊，通常需要在液体培养基培养到期后进 行二次转接培养进行确认，这一操作不仅增加了污染的风险而且增加了无菌检验周期（大于 14 天）。而采用自动化的检测系统可以克服这一缺陷。系统自动化采集生长信号，区别于传统无菌检查的繁琐操作、静态培养以及人为的浊度判读法，降低了无菌操作的风险， 具有结果报告的实时性、可追溯性以及避免人为干扰的优势。本研究从专属性、检测限、重复性、耐用性 4 个方面对丙泊注射液无菌快速检查方法和药典方法进行了比较研究。结果表明，快速方法与药典方法基本相当。采用 BACTEC FX 全自动系统能有效缩短产品阳性检出时间。当然，该系统也有一定的局限性，如样品的接种量有限。在本研究中，我们适当的增加了样品的接种体积，均能准确的给出阳性结果。对于体积较大的注射液，可通过增加接种培养瓶的数量以满足检验要求。另外，本研究的试验不可能覆盖所有的微生物，不能排除对于某些微生物的促生长能力 2 种方法可能不相同。在下一步研究中，需要增加试验菌株的种类，特别是产品生产环境微生物的考察。
综上，选择 BACTEC FX 全自动系统的作为药品无菌快速检查方法时，首先应考察样品的特性，其次根据快速检测方法及样品的特点增加相应的菌株进行全面的评价。应用BACTEC FX 全自动系统作为无菌快速检测方法，可为常规无菌检查法带来有效的补充。
参考文献
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[4]EP 10.0. Vol I [S].2019：191-198.
[5] JP XVII [S]. 2016:130-134.
[6] 宋光艳,冯震,潘盈盈,等.流式细胞技术在药品无菌检查中的应用研究[J].中国药师, 2018,21(2):342-345.SONG GY, FENG Z, PAN YY, et al. Study on the Application of Flow Cytometry in Drug Sterility Test [J]. Chi Pharm, 2018,21(2):342-345.
注：摘引上海药检所文章关于FX40在快速无菌领域的应用。
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